A traditional medicine, respiratory detox shot (RDS), inhibits the infection of SARS-CoV, SARS-CoV-2, and the influenza A virus in vitro
Brian Hetrick1, Dongyang Yu2, Adeyemi A. Olanrewaju1, Linda D. Chilin1, Sijia He1, Deemah Dabbagh1,Ghaliah Alluhaibi1, Yuan - Chun Ma3, Lewis A. Hofmann4, Ramin M. Hakami1 and Yuntao Wu1*
▋摘要
背景：现今仍要首当其冲世界的新型冠状菌株病 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个国家和地区大流行，截至 2021 年 4 年末已引发少于 1.28 亿人染病，少于 280 万人丧命。举例来说，已确定可有效率减缓 COVID-19 误杀率的疗法方法有。我们深入研究了一种传统观念的里面肉桂用药有效成分——惟有肺毒用药液 (RDS) 的潜在外用冠状菌株已逝性，该用药液主要含有为中国地区药理学传统观念里面常用疗法胸腔病因的里面肉桂。
结果：RDS 消除 SARS-CoV 较慢菌株、SARS-CoV-2 较慢菌株、混和病致癌菌株-SARS-CoV-2(Ha-CoV-2) ；也型菌株以及传染性 SARS-CoV-2 和引申的 Ha-CoV-2 混种菌株 (B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.429、B.1.2、B.1.494、B.1.1.207、B.1.258 和 B.1.1.298) 对细胞内会的染病。我们全面展示出 RDS 可以必要灭已逝 SARS-CoV-2 菌株致密的传染性。此外，我们见到 RDS 还可堵塞病致癌霍乱菌株对细胞内会的染病。
假设：RDS 可广为消除口腔菌株染病。词条：SARS-CoV-2，COVID-19，冠状菌株，外用菌株疗法，惟有肺毒用药液，传统观念里面肉桂，SARS-CoV，病致癌霍乱，Ha-CoV-2，SARS-CoV-2 ；也型菌株
▋背景
现今仍要首当其冲世界的新型冠状菌株病 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个国家和地区大流行，截至 2021 年 4 年末已引发少于 1.28 亿人染病，少于 280 万人丧命。举例来说，已确定可有效率减缓 COVID-19 误杀率的疗法方法有。新浮现的 COVID-19 菌株病原体为冠状菌株 SARS-CoV-2[1]，是 SARS-CoV 在严重急性呼出气病症具体冠状菌株种类里面的同父菌株[2,3]。SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 最初都是在里面国见到的；SARS-CoV 菌株于 2002 年 11 年末在广东省首次被见到[4-6]，SARS-CoV-2 则于 2019 年 12 年末在上海首次被见到[1,7,8]。在里面国，这两次由冠状菌株惹来的非典型肺炎里面，里面肉桂外被广为符合，来进行立即快速反应冠状菌株惹来的病因。对于举例来说的 COVID-19 大流行，里面国有少于 85% 的 SARS-CoV-2 染病病征接受了传统观念里面医药疗法（9，10）。许多符合的里面肉桂是否很强有效率的外用冠状菌株特性并在病理上是否有效率，这个关键问题即已得不到必要答复。
里面肉桂作为疗法冠状菌株所引发病因的有效率疗法，但由于欠缺毒素或排泄的控制系统深入研究，其的发展与不合理符合外受到了阻碍。为了确切里面肉桂的潜在外用 SARS-CoV-2 已逝性，我们从常用里面肉桂里面择优了多种肉桂杀菌剂，并从里面肉桂用药液 RDS(旧金山一种赢利性的食品补充剂) 里面见到了外用 SARS-CoV 和外用 SARS-CoV-2 菌株的已逝性，一种在旧金山的赢利的食品补充剂。RDS 常用加强消化系统肠胃的总体肥胖，其还除此以外多种肉桂含有，如灵芝和荆芥，它们是传统观念上常用掌控上皮细胞和胸腔病因的里面肉桂 (11-13)。在此，我们华盛顿邮报 RDS 对 SARS-CoV、SARS-CoV-2 ；也菌株以及很强染病性的野生型 SARS-CoV-2 菌株对细胞内会的染病很强消除抑制作用。我们全面验证 RDS 可通过必要灭已逝菌株致密或阻止菌株侵入而消除菌株的现代染病延迟。此外，我们见到 RDS 还可以阻止甲流菌株对细胞内会的染病。这些分析表明，RDS 对口腔菌株的染病意味著很强广为的消除抑制作用。
▋结果
为了从传统观念里面肉桂里面见到潜在的外用 SARS-CoV-2 已逝性，我们从约四十种传统观念肉桂里面择优提取出 SARS-CoV-2S 受体；也型较慢菌株[14,15] 和消化系统胸腔 A549(ACE2) 细胞内会，此本能 ACE2 基因会通过较慢菌株转导作为表征特异性，从而稳定转导来做到超表述。较慢；也型菌株符合绿色荧光受体 (GFP) 或荧光亦同酶 (Luc) 作为华盛顿邮报基因，并通过了很强广谱外用菌株转入消除剂，以及的兄弟帕尔 (Arbidol)[16]，和本能外用毒血清对外用 SARS-CoV-2(左图 1a、C) 的验证。我们并不需要尝试监测到的兄弟帕尔 (Arbidol) 和外用毒血清对于 SARS-CoV-2 ；也型菌株的消除抑制作用，这是我们在其他四十余种传统观念肉桂杀菌剂的测试里面不能见到的，除此以外其里面一些坎遍存在较高致癌的肉桂 (左图 1a-C)。然而，鉴于较慢性；也型菌株只能能监测 SARS-CoV-2 菌株的侵入行为，我们不能排除这些肉桂杀菌剂意味著有在转入后阶段性并不需要消除 SARS-CoV-2 的意味著性。我们全面从传统观念用药惟有肺毒用药液 (RDS) 里面择优出了意味著的外用 SARS-CoV-2 已逝性，该厂商掺入九种肉桂含有——、奎宁、灵芝、荆芥、当归、苦杏仁、蜂房、皂角、胭脂，在里面国传统观念上常用疗法胸腔病因 (11-13)。
掺入苯基咖啡硫酸、3，4-二邻咖啡酰基精油硫酸、苯基 3，4-二邻咖啡酰基精油硫酸、原儿茶硫酸、苯基绿原硫酸和木犀草亦同；花蕾里面还掺入引申物 A、B 和 10 种已知环烷醚CHO引申物[17]；该混种还掺入皂甙甙 A 和 B，以及外用上皮细胞抑制作用的引申物 C[18,19]。奎宁酯引申物里面掺入木脂亦同、松脂醇和奎宁引申物[20]。灵芝里面掺入被称为灵芝皂引申物的甾体皂引申物，是灵芝科混种独有的混种化学物质[21,22]。细叶荆芥里面主要已逝性含有为四种单CHO，(−)-杏仁酮、(+)-坎巴德酮、(−)-柠檬烷和 (+)-杏仁苯酚；这种混种还掺入其他氧化物，如 1-辛烷-3-醇、3-辛酮、β-年末桂烷和β-石竹烷[23]。当归掺入少于 162 种氧化物，除此以外环烷醚CHO和环烷醚CHO引申物、苯丙引申物、苯甲硫酸、CHO类、糖类、抗氧化剂、和皂引申物[24]。苦杏仁里面掺入酚类、氰基氧化物和果胶多糖[25]。皂角刺里面掺入皂引申物和羽扇豆硫酸[26,27]，而胭脂里面掺入主要已逝性含有胭脂硫酸[28]。为了全面的测试 RDS 的外用 SARS-CoV-2 已逝性，用不同固体沸点的 RDS 函数调用 A549(ACE2) 细胞会，然后让这些细胞会在坎遍存在 RDS 的完全接受 4-6 星期的染病。染病后，在不坎遍存在 RDS 的完全培育出细胞会，然后在 48 和 72 星期的时候，通过流式细胞会精对菌株染病的消除抑制作用同步进行分析。为了掌控细胞会致癌，符合氟化丙啶 (PI) 对将会丧命和已丧命的细胞会同步进行上色，只能在已逝细胞会群里面分析 GFP+细胞会。如左图 2 右图，我们通过观察到 RDS 对 SARS-CoV-2(GFP) ；也菌株很强mg发挥抑制作用消除抑制作用。为了证实这些结果，我们符合内源性表述 ACE2 的 VeroE6 细胞会单调了该染病实验者。
(见下页左图)
ACE2 核心表述，生产性 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 菌株可对其同步进行染病，ACE2 通常常用冠状菌株的深入研究 (7)。直接影响在欠缺 ACE2 超表述 [15，29，30] 的完全，；也型菌株对 VeroE6 的染病性较低，我们还符合了荧光亦同酶华盛顿邮报基因；也型菌株，该菌株的华盛顿邮报基因表述由 HIV-1LTR 和 Tat 驱动，很强更高的华盛顿邮报基因持续性和传输速率。
左图 2：RDS 消除 SARS-CoV-2(GFP) ；也型菌株染病 A549(ACE2) 细胞会。
A.A549(ACE2) 细胞会用 RDS 整年固体 30 分钟后，用 SARS-CoV-2(GFP) ；也型菌株染病。将细胞会洗去菌株和 RDS，并在不坎遍存在 RDS 的完全同步进行培育出。流式细胞会仪监测菌株染病消除上述情况。未染病的细胞会和染病 SARS-CoV-2(GFP) 但无权 RDS 疗法的细胞会作为相符合。GFP+细胞会平均值已标示出。(PI) 氟化丙啶。
B.RDS 的细胞会致癌计量。A549(ACE2) 细胞会用 RDS 整年固体 4 星期，洗去 RDS，无 RDS 培育出 48 星期。氟化丙啶上色鉴别仍要在丧命细胞会和已丧命细胞会，流式细胞会精分析。插图mg-中间体细胞会致癌曲线，RDS 的半误杀沸点 (LC50) 比率为 1:11.9。
如左图 3A 右图，我们符合 Luc 报告基因；也菌株和 VeroE6 细胞会同步进行染病实验者，通过观察到 RDS 对该菌株染病很强mg发挥抑制作用消除抑制作用，并且半数消除沸点确切为 1:230RDS 固体度 (左图 3B)。我们还分析了 RDS 对 VeroE6 细胞会已逝力的因素，确切了 50% 细胞会丧命mg为 1:11.8RDS 固体度。
左图 3：RDS 对 SARS-CoV-2(Luc) ；也菌株和野生型 SARS-CoV-2 菌株的mg发挥抑制作用消除消除抑制作用。用 RDS 整年固体函数调用 A、BVeroE6 细胞会，并用 SARS-CoV-2(Luc) ；也型菌株染病。将细胞会洗去菌株和 RDS，并在不坎遍存在 RDS 的完全同步进行培育出。在染病后 72 星期用荧光亦同酶监测菌株染病的消除抑制作用。未染病细胞会和 SARS-CoV-2-luc 染病但无权过 RDS 疗法的细胞会作为相符合。实验者单调三次。插图mg中间体曲线和 RDS 的 I-C50 固体比率为 1:230。CRDS 对 VeroE6 细胞会的细胞会致癌也通过氟化丙啶上色和流式细胞会精计量。用 RDS 整年固体 4 星期，洗去 RDS，在不计有 RDS 的完全培育出 72 星期。插图细胞会致癌mg-中间体曲线，RDS 的半误杀沸点 (LC50) 比率为 1:13.8 固体。DRDS 消除传染性 SARS-CoV-2 染病。用整年固体的 RDS 函数调用 VeroE6 细胞会，并在 RDS 坎遍存在的完全染病 SARS-CoV-2。染病 48 星期后，通过炎菌斑分析菌株释放后的菌株复制消除上述情况。消除试制一式三份同步进行，并在 Prism7(Graph Pad) 里面符合单向正态分布 (One-Way ANOVA) 分析及 Dunnett 后化验 (Dunnett's Post Test)，以此确切统计显着性。不确定性值用星号表示如下：*p
为了全面验证符合；也菌株获得的结果，我们的测试了 RDS 对于 SARS-CoV-2 染病的堵塞传染性意志力。如左图 3D 右图，RDS 同时也堵塞了 SARS-CoV-2 对 VeroE6 细胞会的染病。RDS 在固体 1:40 以上时可明显减少菌株白斑的形成。
综上，通过 SARS-CoV-2 ；也菌株与传染性菌株的分析表明，RDS 掺入消除 SARS-CoV-2 染病的已逝性含有，意味著是通过必要灭已逝菌株或堵塞菌株的现代染病延迟。
为全面深入研究意味著的控制系统，我们将传染性 SARS-CoV-2 菌株致密与整年固体的 RDS 在 37°C 下预培育出 1 星期。随后，将固体全面依次固体-(10–1 至 10–4)，并转入 Vero 细胞会同步进行炎菌斑分析以确切菌株染病性的减缓。如左图 4A 右图，我们通过观察到在 RDS 里面短暂沾染一星期后的菌株致密，其 SARS-CoV-2 的染病效价也长方形mg发挥抑制作用下降。该结果证实了 RDS 可有效率必要灭已逝 SARS-CoV-2 菌株致密的传染性。
我们全面的测试了 RDS 是否也能消除 SARS-CoV-2 菌株混种的染病。为此，我们利用最近整合的混和甲菌株-SARS-CoV-2 ；也型菌株 (Ha-CoV-2)[31] 来固体一系列 S 受体类似于，除此以外美国类似于 (B.1.1.7)，南非类似于 (B.1.351)，巴西类似于 (P.1)，加州类似于 (B.1.429)，和其他几个新兴类似于 (B.1.2，B.1.494，B.1.1.207B.1.258，B.1.1.298)。Ha-CoV-2(Luc) 和具体 S 受体表征体在 37°C 整年固体 RDS 培育出 1 星期。随后，用该固体染病 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 细胞内会。染病后 12 星期，荧光亦同酶校准菌株染病的消除抑制作用。如左图 4B 右图，我们还通过观察到了 RDS 对 Ha-CoV-2(Luc) 和所有 S 受体类似于的mg发挥抑制作用消除。
我们还的测试了 RDS 堵塞 SARS-CoV 染病的意志力，符合比如说 SARS-CoV 突刺受体的 GFP 华盛顿邮报基因较慢菌株和[15] 只能只能只是mg。我们将人 A549(ACE2) 细胞会用于细胞内会，将其用系列固体的 RDS 函数调用，然后用 SARS-CoV(GFP) 报告基因；也菌株染病 4-6 星期。染病后在不计有 RDS 的完全培育出细胞会，流式细胞会精分析监测其对菌株染病的消除抑制作用。同样，符合氟化丙啶排除仍要在丧命与已丧命的细胞会，只能在已逝细胞会群里面分析 GFP+细胞会。如左图 5A 右图，我们通过观察到 RDS 对 SARS-CoV(GFP) ；也型菌株的消除抑制作用长方形mg发挥抑制作用。我们全面证实了这些结果，并分析了 RDS 特异性的消除与 Luc 华盛顿邮报基因 SARS-CoV ；也型菌株，SARSCoV(Luc)。我们通过观察到 RDS 对 SARS-CoV(Luc) 和的消除抑制作用长方形mg性依赖性，其半消除沸点 (IC50) 为 1:70.88 固体度 (左图 5B，C)。直接影响 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 都符合 ACE2 染病细胞内会，我们还的测试了 RDS 的外用菌株已逝性是否只能针对与 ACE2 有相互抑制作用的冠状菌株。为此，我们监测了一种不具体的负链 RNA 菌株---病致癌霍乱菌株。它通过菌株血凝亦同 (HA) 和细胞会α-唾液硫酸来染病细胞内会。为了固体病致癌霍乱菌株，将表述病致癌霍乱 A/WSN/33(H1N1) 基因组每个片断的 8 个表征和一个 GFP-华盛顿邮报基因共有转染到 HEK293T 细胞会里面。在 RDS 坎遍存在的完全，得来菌株致密并常用染病最大限度 MDCK 细胞会。如左图 6A 右图，我们通过观察到 RDS 对病致癌霍乱菌株的消除抑制作用长方形mg发挥抑制作用。RDS 在 1:40 和 1:80 固体时可完全堵塞菌株染病，在 1:160 固体时则可部分消除病致癌霍乱。RDS 对 MDCK 细胞会的半误杀沸点 (LC50) 经校准为 1:18.5(左图 6B)。这些分析表明，RDS 的外用菌株已逝性并非针对特定菌株，而意味著并不需要广为消除多种口腔菌株，如冠状菌株和病致癌霍乱菌株。
▋辩论
在本报告里面，我们展示出传统观念用药惟有肺毒用药液 (RDS) 掺入广谱外用菌株已逝性，可堵塞 SARS-CoV、SARSCoV-2 和病致癌霍乱菌株的染病。虽然 RDS 并不需要消除多种菌株，但其外用菌株已逝性因菌株多种类型和HIV而异。例如，对 SARS-CoV 较慢；也菌株的 I-C50 沸点为 1:7.9 固体度，对 SARS-CoV-2 较慢；也菌株的 I-C50 沸点为 1:230 固体度。对于传染性野生型 SARS-CoV-2 菌株，I-C50 为 1:40 固体度，对病致癌霍乱，其 I-C50 为 1:250。RDS 对 Ha-CoV-2 及其混种有不同的消除抑制作用，IC50 数值从 1:70 到 1:2601 固体度大概 (左图 4B)。
(见下一页左图)
左图 4 RDS 对 SARS-CoV-2 和引申的 Ha-CoV-2 混种很强mg发挥抑制作用灭已逝抑制作用。ASARS-CoV-2 致密加整年固体的 RDS 在 37°C 下培育出 1 星期。随后，将固体全面整年固体，并转入 Vero 细胞会里面同步进行炎菌斑分析，以确切菌株染病性减缓。消除试制一式三份同步进行，并在 Prism7(GraphPad) 里面符合单向正态分布 (One-WayANOVA) 分析和 Dunnett 后化验 (Dunnett'sPostTest) 以此确切统计显着性。不确定性值用星号表示如下：*p
BHa-CoV-2(Luc) 和具体 S 受体类似于与整年固体的 RDS 在 37°C 培育出 1 星期后，用固体染病 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 细胞内会。染病后 12 星期，荧光亦同酶校准菌株染病的消除抑制作用。RDS 的 IC50 值的固体度为 1:177(wt)，1:828(B.1.1.7)，1:124(B.1.351)，1:88(P.1)，1:134(B.1.1.207)，1:2601(B.1.1.298)，1:70(B.1.258)，1:362(B.1.429)，1:163(B.1.494)，1:137(B.1.2)。
我们全面展示出 RDS 可以消除冠状菌株的现代染病延迟。虽然具体的外用菌株控制系统即已正确，但 RDS 可以通过必要灭已逝菌株致密或通过阻止菌株侵入或堵塞菌株侵入后的现代延迟来阻止菌株染病。在其他几种传统观念里面肉桂里面也见到了外用 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 的已逝性。例如，一种常见的传统观念里面肉桂——胭脂。
胭脂根里面已验证掺入胭脂硫酸亦同，可消除 SARS 菌株[32] 病理裂解株的复制。此外，另一种可常用疗法口腔病因的里面肉桂——双黄连有效成分，已标示出出在排泄以mg发挥抑制作用于法消除 SARS-CoV-23CL 受体酶 (3CLpro) 已逝性。冬青引申物和冬青亦同拟作为双黄连堵塞 3CLpro[33] 的生命体碱。
左图 5 RDS 消除 SARS-CoV ；也型菌株对 A549(ACE2) 细胞会的染病。用整年固体的 RDS 函数调用 A、B 细胞会，用 SARS-CoV(GFP)(A) 或 SARSCoV(Luc)B ；也型菌株染病。将细胞会清洗，替换成菌株和 RDS，在不坎遍存在 RDS 的完全同步进行培育出。在染病后 48 星期和 72 星期，通过流式细胞会精或荧光亦同酶监测来计量菌株染病的消除抑制作用。实验者单调三次。插图mg拥护曲线，并插图 RDS 的 IC50 值为 1:70.9 固体度 (C)
左图 6 RDS 消除甲流菌株对 MDCK 细胞会的染病。(A) 用整年固体的 RDS 函数调用 MDCK 细胞会 30 分钟，然后用甲流菌株 (GFP) 对其同步进行染病。染病后，在 RDS 坎遍存在下培育出细胞会。36 星期后用流式细胞会仪对菌株染病的消除抑制作用同步进行计量。把未染病的细胞会与被甲流菌株 (GFP) 染病但无权 RDS 处理的细胞会同步进行对比。左图里面标示出了 GFP+细胞会的平均值。PI 表示氟化丙啶 PI。
(B) 另外还符合了 MTT 校准法计量了 RDS 对 MDCK 细胞会的致癌，插图了细胞会致癌的mg-中间体曲线，经计算，RDS 的半数误杀沸点为 1:18.5 固体度 RDS 的有效率外用菌株含有即已确切。然而，RDS 不同于冬青引申物和冬青亦同，RDS 可以通过必要灭已逝菌株带电粒子来堵塞菌株染病 (左图 4)，而冬青引申物和冬青亦同则在菌株生命周期的后期通过堵塞菌株受体酶的已逝性来发挥抑制作用。然而，RDS 的排泄外用 SARS-CoV-2 已逝性仍需在更全面的生物深入研究和本能病理试制里面得不到证实。现今，我们仍要在同步进行小型生物实验者，以确切 RDS 在毒素堵塞 SARS-CoV-2 菌株染病的潜力。
▋假设
我们的深入研究表明，RDS 可广为消除口腔菌株的染病，如 SARS-CoV、SARS-CoV-2 和病致癌霍乱。
▋方法有
细胞会和细胞会培育出
HEK293T (ATCC 福纳奇克，密西西比州) MDCK (ATCC 福纳奇克，密西西比州)，VeroE6 (ATCC 福纳奇克，密西西比州) 和 A549 (ACE2) (来自 Virongy LLC 还给，福纳奇克，密西西比州)，和 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) (来自 Virongy LLC 还给，福纳奇克，密西西比州) 现今保有于 Dulbecco's modifiedEagle's medium (DMEM) (赛默飞世尔科技 Thermo Fisher Scientific) 掺入 10% 微灭已逝 FBS 和 1×青霉亦同-抗生亦同 (赛默飞世尔科技 Thermo Fisher Scientific)。在 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 细胞会菌种里面分别以 1μg/ml 和 200μg/ml 的沸点转入嘌呤霉亦同和潮霉亦同 B。
核糖体转染和菌株固体
计有 SARS-CoVS 受体或 SARS-CoV-2S 受体的较慢性；也型菌株致密由 Virongy LLC (Manassas，VA) 备有，或按照在后叙述的方法有[15] 固体。简言之，为了固体 GFP 华盛顿邮报基因较慢性；也菌株，HEK293T 细胞会与表述 SARS-CoVS 受体或 SARS-CoV-2S 受体的表征、pCMVΔR8.2 和 pLKO.1-puro-TurboGFP 共有转染。为了存量荧光亦同酶华盛顿邮报基因较慢性；也型菌株，将 HEK293T 细胞会与表述 SARSCoVS 受体或 SARS-CoV-2S 受体的表征、pCMVΔR8.2 和 pLTR-Tat-IRES-Luc 同步进行共有转染。转染后 48 星期得来菌株上清液，离心浓缩，−80℃ 保有。野生型 SARS-CoV-2 菌株 (Isolate USA-WA1/2020) 由 BEI Bioresources (Manassas，VA) 备有。pHW-NAGFP (ΔAT6) 报告基因核糖体和 A/WSN/1933 H1N1 引申核糖体 pHW2000-PB2、pHW2000-PB1、pHW2000-PA、pHW2000-HA、pHW2000-NP、pHW2000-NA、pHW20000M 由 FengLi 博士密切联系备有。在霍乱菌株 A-GFP 华盛顿邮报基因带电粒子固体里面，将 pHW2000-pb2、pHW2000-pb1、pHW2000-PA、pHW2000-ha、pHW2000-np、pHW2000-na、pHW2000-m、pHW2000-ns 和 pHW-NA-GFP 共有转染 HEK293T 细胞会 (ΔAT6)。48 星期后得来菌株上清液。SARS-CoV-2S、M、E、N 表述表征购自 Sinobiological。利用 Twist Bioscience 合成了 Ha-CoV-2(Luc) 表征和 S 受体表征表征。Ha-CoV-2(Luc) 和 S 受体表征带电粒子按照在后叙述方法有[31] 同步进行固体。
菌株染病和用药消除试制
RDS(惟有肺毒用药液)(来自 Dejia Harmony 还给，利斯堡，密西西比州) 是由福博士研究为中心 (Burnaby，BC，Canada) 生产的一种赢利厂商。RDS 里面所有里面肉桂含有外符合《里面国药典 2015 年版》「饮片」标准，除此以外生命体碱计有量及重金科、除草剂限量监测。RDS 是一种里面肉桂的共有熬剂，终究产物在自由电子条件下蒸发。SARS-CoV-2 外用血清由 LanceA. Liotta 内科医生备有。将的兄弟朵尔盐硫酸盐 (Sigma) 重新悬浮在二苯基亚砜 (Sigma) 里面。对于；也型菌株染病，12 孔板里面的 A549(ACE2) 细胞会 (来自 Virongy LLC 还给，福纳奇克，密西西比州) 或 VeroE6 细胞会用 RDS 函数调用 30 分钟，在 37℃ 下染病 4-6 星期，然后在新鲜菌种里面温水培育出 48-72 星期。对于 VeroE6 细胞会的染病，细胞会也被 CoV-2 ；也型菌株染病加强剂 (CoV-2PIE) (来自 Virongy LLC 还给，福纳奇克，密西西比州) 函数调用后，在 37°C 下再处理 30 分钟。符合 GloMaxDiscover 酶标仪 (Promega) 分析细胞会裂解物的荧光亦同酶已逝性。对于野生型 SARS-CoV-2 染病，VeroE6 细胞会在 37°C 下用 RDS 函数调用 30 分钟，然后用 MOI 为 0.05 染病 SARS-CoV-2 (Isolate USA-WA1/2020；BEI Bioresources) 在乔治米切尔学院的 BSL-3 收治设施内相隔 1 星期。细胞会用 PBS 温水 2 次，用计有 RDS 的菌种培育出 48 星期。从上清里面提取菌株，用 12 孔板培育出的 Vero 细胞会单层里面的炎菌斑试制校准小瓶滴度。简言之，每个材料在完备的 Dul-becco's ModifiedEagle 菌种 (VWR) 里面固体，还除此以外 1X 青霉亦同-抗生亦同 (VWR)，并转换成 10% 的 FBS(赛默飞世尔科技 Thermo Fisher Scientific)。然后将 200 微升的每种固体液附着到 VeroE6 细胞会单层的三个平行孔上 1 星期。然后用 1～2 ml0.6% 琼脂糖 (Invitrogen) 和一部分完备的 Eagle Minimal Essential 菌种 (VWR) 的固体遮盖单层，计有 1X 青霉亦同-抗生亦同，并转换成 10%FBS。48 星期后，将单层膜固定在 10% 甲醛溶解里面 1 星期，并转换成遮盖的琼脂塞。为了上色白斑，转入掺入 20% 甘油的 1% 结晶紫染色溶解 5 分钟，然后用去离子水温水。对于病致癌霍乱菌株染病 MDCK 细胞会，在 37°C 下用 RDS 函数调用 30 分钟，然后用 A-GFP 华盛顿邮报基因菌株染病 6 星期。用计有 RDS 的菌种温水细胞会，培育出 36 星期。GFP 表述通过流式细胞会仪计量。(FACSCalibur，BD Biosciences).
对于 SARS-CoV-2 菌株致密的 RDS 灭已逝试制，将 100μl 整年固体的 RDS 转换成到 1 mlSARS-CoV-2 菌株原液 (3.65×105PFU/ml) 里面，终究 RDS 固体为 1:20，1:40 或 1:80。也除此以外相符合条件 (1 ml 菌株+100μl 菌种)。固体在 37°C 下培育出 1 星期。随后，对固体同步进行系列固体以产生额外的 1:10、1:100、1:1,000 和 1:10,000 固体度，并将整年固体的材料转入 12 孔板里面的 Vero 细胞会里面，常用同步进行炎菌斑校准分析。白斑校准里面终究的 RDS 固体度为 1:200 至 1:200,000；1:400 到 1:400,000；和 1:800 到 1:800,000 的 RDS 固体液。
Ha-CoV-2(Luc) 和 S 受体表征带电粒子按照在后叙述的方法有[31] 固体。对于 Ha-CoV-2(Luc) 的 RDS 灭已逝，将 5μl 整年固体的 RDS 转换成到 45μlHa-CoV-2(Luc) 或类似于里面，终究 RDS 固体度为 1:20、1:40、1:80、1:160 或 1:320。将固体在 37°C 下培育出 1 星期，然后在 RDS 坎遍存在下染病 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 细胞会 12 星期。符合 GloMax Discover 酶标仪 (Promega) 分析细胞会裂解物的荧光亦同酶已逝性。
细胞会致癌分析监测
用氟化丙啶上色和流式细胞会精分析对 A549 (ACE2) 细胞会和 VeroE6 细胞会的用药细胞会致癌同步进行监测，如所述 (34)。符合细胞会增殖路易斯硫酸盒 I(MTT) (Sigma) 和制造商敦促的方案对 MDCK 细胞会的用药致癌同步进行分析。简言之，将 MDCK 细胞会 (ATCC) 以每孔 1×-105 个细胞会的速度接种到 12 孔板里面。细胞会培育出隔夜后，通过 RDS 处理 1 天，然后在 MTT 标记路易斯硫酸 (Sigma) 的菌种里面培育出。将细胞会与标记路易斯硫酸共有同培育出 4 星期，再近期转入 MTT 增溶解。培育出皿孵育过夜，用 GloMax Discover 酶标仪 (Promega) 校准出气伴星。
缩写
SARS-CoV：严重急性肠胃病症具体冠状菌株；SARSCoV-2：Severe 严重急性肠胃病症具体冠状菌株-2；TCM：传统观念里面肉桂；RDS：口腔排毒用药液；Ha-CoV-2：混和病致癌新冠菌株；也菌株。
致谢
感谢 FengLi 备有霍乱菌株表述表征，感谢 LanceLiotta 备有外用毒血清；感谢 TedCi，HeSun，ZhigangGao，WanyingWu 的辩论与敦促；感谢 KevinCarter、MarkMamdar、RichKeurajian、KarenFreidouni 备有 RDS 和肉桂杀菌剂。
原作者贡献
此次实验者由 Y.W.，R.H. 和 L.A.H. 设计，由 Y.W. 撰写，由 L.A.H. 编辑。B.H.，D.Y.，A.A.O.，L.D.C.，S.H.，D.D、GA 及 YM 执行了该实验者。所有原作者已阅读并批准终究稿件。
经费
本深入研究的经费来自于乔治米切尔学院核心捐助 223741(DeJiaHarmony/Anti-SARS-CoV-2)，该款项由德佳和畅 (DeJiaHarmony) 备有。
图表和材料的可用性
本深入研究里面产生或分析的所有图表外还除此以外在本文里面。路易斯硫酸可从 Y.W 处获取。
声明
批准及投身于允诺
不符合
允诺编辑出版
不符合
竞争利益
乔治米切尔学院国家生命体威慑和黄微病里面心的 RMH 和 YW 已获得了德佳和畅 (DejiaHarmony) 的深入研究捐款，LAH 为德佳和畅出任顾问并获得了回报。不能其他关连或已逝动意味著会因素到提交的实习。
原作者详细信息
1旧金山密西西比州乔治米切尔学院计算机科学学院国家生命体威慑和黄微病里面心，福纳奇克 20110。
2VirongyLLC，密西西比州福纳奇克。3加拿大伯纳比，BCV5J0E5 福博士研究为中心 (Dr.Ma's LaboratoriesInc.)。4 旧金山密西西比州利斯堡联合国大会社会科学组织起来，20176。
收稿时间表：2021 年 4 年末 7 日
接受时间表：2021 年 5 年末 10 日
线上编辑出版时间：2021 年 5 年末 29 日
参考文献
1. Zhu N, Zhang D, Wang W, Li X, Yang B, Song J, et al. A Novel Coronirus from Patients with Pneumonia in China, 2019. N Engl J Med. 2020;382(8):727–33.
2. Wu Y, Ho W, Huang Y, Jin D, Li S, Liu S, et al. SARS-CoV-2 is an appropriate name for the new coronirus. Lancet. 2020;395(10228):949–50.
3. Gorbalenya AE, Baker SC, Baric RS, de Groot RJ, Drosten C, Gulyaeva AA, et al. Coroniridae Study Group of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Nat Microbiol. 2020;5:536–44.
4. Drosten C, Günther S, Preiser W, van der Werf S, Brodt H-R, Becker S, et al. Identification of a novel coronirus in patients with severe acute respiratory syndrome. N Engl J Med. 2003;348(20):1967–76.
5. Ksiazek TG, Erdman D, Goldsmith CS, Zaki SR, Peret T, Emery S, et al. A novel coronirus associated with severe acute respiratory syndrome. N Engl J Med. 2003;348(20):1953–66.
6. Peiris JSM, Lai ST, Poon LLM, Guan Y, Yam LYC, Lim W, et al. Coronirus as a possible cause of severe acute respiratory syndrome. Lancet. 2003;361(9366):1319–25.
7. Zhou P, Yang X-L, Wang X-G, Hu B, Zhang L, Zhang W, et al. A pneumonia outbreak associated with a new coronirus of probable bat origin. Nature. 2020;579(7798):270–3.
8. Wu F, Zhao S, Yu B, Chen Y-M, Wang W, Song Z-G, et al. A new coronirus associated with human respiratory disease in China. Nature. 2020;579(7798):265–9.
9. Yang Y, Islam MS, Wang J, Li Y, Chen X. Traditional Chinese medicine in the treatment of patients infected with 2019-new coronirus (SARS-CoV-2): a review and perspective. Int J Biol Sci. 2020;16(10):1708–17.
10. Ling CQ. Traditional Chinese medicine is a resource for drug discovery against 2019 novel coronirus (SARS-CoV-2). Journal Integr Medicine. 2020;18(2):87–8.
11. Shan M-Q, Qian Y, Yu S, Guo S-C, Zhang L, Ding A-W, et al. Anti-inflammatory effect of volatile oil from Schizonepeta tenuifolia on carrageenininduced pleurisy in rats and its application to study of appropriate harvesting time coupled with multi-attribute comprehensive index method. J Ethnopharmacol. 2016;194:580–6.
12. Jung ID, Kim HY, Park JW, Lee CM, Noh KT, Kang HK, et al. RG-II from Panax ginseng C.A. Meyer suppresses asthmatic reaction. BMB Reports. 2012;45(2):79–84.
13. Wu W, Li R, Li X, He J, Jiang S, Liu S, et al. Quercetin as an antiviral agent inhibits influenza A virus (IAV) entry. Viruses. 2015;8(1):6. doi. org/
10. 3390/ v8010 006. 14. Belouzard S, Chu VC, Whittaker GR. Activation of the SARS coronirus spike protein via sequential proteolytic cleage at two distinct sites. Proc Natl Acad Sci USA. 2009;106(14):5871–6.
15. He S, Waheed AA, Hetrick B, Dabbagh D, Akhrymuk IV, Kehn-Hall K, et al. PSGL-1 inhibits the incorporation of SARS-CoV and SARS-CoV-2 spike glycoproteins into pseudovirus and impairs pseudovirus attachment and infectivity. Viruses. 2021;13(1):46. doi. org/ 10. 3390/ v1301 0046.
16. Boriskin YS, Leneva IA, Pecheur EI, Polyak SJ. Arbidol: a broad-spectrum antiviral compound that blocks viral fusion. Curr Med Chem. 2008;15(10):997–1005.
17. Kakuda R, Imai M, Yaoita Y, Machida K, Kikuchi M. Secoiridoid glycosides from the flower buds of Lonicera japonica. Phytochemistry. 2000;55(8):879–81.
18. Son KH, Jung KY, Chang HW, Kim HP, Kang SS. Triterpenoid saponins from the aerial parts of Lonicera japonica. Phytochemistry. 1994;35(4):1005–8.
19. Kwak WJ, Han CK, Chang HW, Kim HP, Kang SS, Son KH. Loniceroside C, an antiinflammatory saponin from Lonicera japonica. Chem Pharm Bull. 2003;51(3):333–5.
20. Din LB, Bedgar DL, Katayama T, Lewis NG. On the stereoselective synthesis of (+)-pinoresinol in Forsythia suspensa from its achiral precursor, coniferyl alcohol. Phytochemistry. 1992;31(11):3869–74.
21. Kim YS, Woo JY, Han CK, Chang IM. Safety ysis of panax ginseng in randomized clinical trials: a systematic review. Medicines. 2015;2(2):106–26.
22. Attele AS, Wu JA, Yuan CS. Ginseng pharmacology: multiple constituents and multiple actions. Biochem Pharmacol. 1999;58(11):1685–93.
23. Yu S, Chen Y, Zhang L, Shan M, Tang Y, Ding A. Quantitative comparative ysis of the bio-active and toxic constituents of lees and spikes of Schizonepeta tenuifolia at different harvesting times. Int J Mol Sci. 2011;12(10):6635–44.
24. Ren D, Shen Z-y, Qin L-p, Zhu B. Pharmacology, phytochemistry, and traditional uses of Scrophularia ningpoensis Hemsl. J Ethnopharmacol. 2021;269:113688.
25. Sefer F, Misirli A, Gülcan R, editors. A RESEARCH ON PHENOLIC AND CYANOGENIC COMPOUNDS IN SWEET AND BITTER KERNELLED APRICOT VARIETIES. 2006: International Society for Horticultural Science (ISHS), Leuven, Belgium.
26. Chong W, Feng XY, Zhen GZ, Dan L, Yue D. Inhibition of mast cell degranulation by saponins from Gleditsia sinensis–structure-activity relationships. Nat Prod Commun. 2009;4(6):777–82.
27. Li WH, Zhang XM, Tian RR, Zheng YT, Zhao WM, Qiu MH. A new anti-HIV lupane acid from Gleditsia sinensis Lam. J Asian Nat Prod Res. 2007;9(6–8):551–5.
28. Nazari S, Rameshrad M, Hosseinzadeh H. Toxicological effects of Glycyrrhiza glabra (Licorice): a review. Phytother Res. 2017;31(11):1635–50.
29. Meltzer B, Dabbagh D, Guo J, Kashanchi F, Tyagi M, Wu Y. Tat controls transcriptional persistence of unintegrated HIV genome in primary human macrophages. Virology. 2018;518:241–52.
30. Wang Z, Tang Z, Zheng Y, Yu D, Spear M, Iyer SR, et al. Development of a nonintegrating Rev-dependent lentiviral vector carrying diphtheria toxin A chain and human TRAF6 to target HIV reservoirs. Gene Ther. 2010;17(9):1063–76.
31. Hetrick B, He S, Chilin LD, Dabbagh D, Alem F, Narayanan A, et al. Development of a novel hybrid alphirus-SARS-CoV-2 particle for rapid in vitro screening and quantification of neutralization antibodies, viral variants, and antiviral drugs. bioRxiv 2020. doi. org/ 10. 1101/ 2020. 12. 22. 423965.
32. Cinatl J, Morgenstern B, Bauer G, Chandra P, Rabenau H, Doerr HW. Glycyrrhizin, an active component of liquorice roots, and replication of SARS-associated coronirus. Lancet. 2003;361(9374):2045–6.
33. Su H-x, Yao S, Zhao W-f, Li M-j, Liu J, Shang W-j, et al. Anti-SARS-CoV-2 activities in vitro of Shuanghuanglian preparations and bioactive ingredients. Acta Pharmacologica Sinica. 2020;41(9):1167–77.
34. Crowley LC, Scott AP, Marfell BJ, Boughaba JA, Chojnowski G, Waterhouse NJ. Measuring cell death by Propidium Iodide uptake and flow cytometry. Cold Spring Harb Protoc. 2016. doi. org/ 10. 1101/ pdb. prot0 87163.
编辑： 翟超男相关新闻
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